Les candidoses
6. Méthodes diagnostiques et identification
Le diagnostic mycologique d’une candidose s’inscrit dans le cadre de la démarche classique d’identification d’un micro-organisme. L’examen direct du prélèvement superficiel est suivi d’une mise en culture permettant d’isoler le ou les germes présents. Les colonies de levures isolées peuvent ensuite être identifiées par la mise en œuvre de tests variés qui reposent sur des critères morphologiques, immunologiques, biochimiques, voire génotypiques [4].
Si l’examen histologique n’est pas réalisé pour chaque cas, l’examen mycologique doit être systématique, en premier lieu pour confirmer le diagnostic de candidose, identifier la levure et enfin pour contrôler l’efficacité du traitement antifongique.
Le prélèvement mycologique.
Le prélèvement de surface est effectué avec un écouvillon porte-coton stéril en frottant les zones où les levures sont retrouvées le plus fréquement. Ces zones correspondent aux foyers de candidoses chroniques.
Si l’on veut éviter les résultats faussement négatifs, il faut s’entourer de certaines précautions. Pour faciliter la réalisation de prélèvement et augmenter son efficacité, surtout dans les hyposialies, il est préférable d’humecter au préalable le porte-coton avec du sérum physiologique. Le prélèvement doit être réalisé en l’absence, depuis quelques jours, de tout traitement antifongique ou antiseptique local ainsi qu’à distance de toute prise d’aliments ou de boissons qui peuvent apporter des levures exogènes mais aussi éliminer une grande partie les levures présentes à la surface de la muqueuse.
Enfin, en raison de la sensibilité des levures à la dessiccation, le prélèvement sera fait de préférence au laboratoire de mycologie afin d’être étudié immédiatement. En cas d’impossibilité, il sera adressé dans du sérum physiologique additionné de chloramphénicol ou éventuellement directement mis en culture par le praticien s’il dispose des milieux de culture appropriés [468].
L’examen direct.
Un fragement du prélèvement, placé sur une lame, est dissocié dans une goutte de sérum physiologique stérile: on observe sans coloration, des petites cellules de 2 à 4μ, à paroi mince, rondes ou ovalaires, bourgeonnantes, accompagnées parfois de filaments mycéliens, formés d’articles de longeur variable, de de 3 à 5μ de diamètre et aux extrêmités arrondies. En l’absence de fragment sur le prélèvement, on réalise un frottis qui sera coloré par le Gram, le May-Grünwald Giemsa ou le PAS [468].
D’autres auteurs recommandent une coloration au lugol à 2%, au bleu de toludine, au bleu de lactophénol ou au noir chlorazole [4].
Rappelons que la présence de blastospores n’est pas pathognomonique d’une candidose, puisqu’un grand nombre de Candida vivent en commensaux dans le tractus digestif ou sur le revêtement cutané. Il est toutefois intéressant l’évaluer leur quantité ce qui permet de révéler un déséquilibre de la flore avec émergence de levures.
Les filaments (mycélium vrai ou pseudomycélium) sont tout particulièrement recherchés, car leur présence est en faveur de la pathogénicité du champignon. La sensibilité de l’examen direct reste cependant assez faible et l’absence d’éléments fongiques visibles ne permet pas s’écarter définitivement le diagnostic de candidose. L’échantillon doit en effet contenir au moins 104 à 105 éléments par millilitre, pour que les Candida puissent êtres détectés dès cette étape [4].
L’examen histologique.
L’examen anatomopathologique se révélèle indispensable pour le suivi des lésions chroniques hyperplasiques comme la paréite candidosique rétrocommissurale afin d’évaluer de degré de dysplasie éventuelle.
D’abord décrit par Cawson (1966) [513] et Cawson et Lehner (1968) [514], l’aspect histologique est variable en fonction de l’homogénéité de la lésion et du degré de dysplasie.
Les lésions blanches homogènes peuvent être aussi bien hyperorthokératinisées qu’hyperparakératinisées [515]. On ne constate habituellement aucune dysplasie sur les lésions homogènes contrairement aux lésions inhomogènes.
La lamina propria présente un infiltrat inflammatoire chronique constitué essentiellement de lymphocyte T (53,9%), de macrophages (14%) et de lymphocytes B (8,2%) [516] et la parakératose de surface peut présenter une séparation irrégulière avec l’épithélium sous-jacent.
Les hyphes peuvent être observés, pénétrant à angle droit l’épithélium à travers la zone de parakératose. Pour une raison inconnue, l’invasion cesse peu après l’entrée dans la stratum spinosum. Il faut préciser que l’invasion de toute l’épaisseur de l’épiderme n’est jamais observée, même chez les patients au stade sida dont les défenses cellulaires sont pratiquement inexistantes.
Une autre caractéristique des candidoses chroniques hyperplasiques est la formation d’agrégat de PMN formant des microabcès au voisinage des hyphes [517].
La coloration par l’acide périodique de Schiff (PAS) et l’imprégnation argentique de Gomori-Grocott sont les colorations habituelles. La coloration par hématéine-éosine-safran (HES) permet quant à elle d’apprécier la réaction tissulaire de l’hôte.
Depuis quelques années, avec le développement des techniques d’immunohistochimie, on utilise des anticorps mono ou polyclonaux pour détecter des Candida présents dans des coupes histologiques parafinées [518].
La culture.
Le classique milieu de Sabouraud est le mieux adaptés à la culture de levures. Il est composé de 35 g de glucose, 15 g d’agar agar, de 10 g de peptone pepsique de viande aditionné à 1 litre d’eau distillée. Son pH est compris entre 5,7 et 6.
Les boîtes de Petri offrent une surface d’ensemencement plus importante que les tubes permettant de bien isoler les colonies et de visualiser les associations de levures. Par contre, le risque de contamination par des spores aéroportées est plus important et les milieux se désèchent en quelques semaines.
L’ensemencement se fait de façon stérile par des mouvements de rotations ou de balayage de l’écouvillon à la surface de la gélose, jusqu’à épuisement du liquide.
Les milieux de culture
Les milieux standards.
Ils ne permettent pas l’identification des différentes espèces de Candida. On utilise une boîte de Petri dans laquelle le milieu de Sabouraud est additionné de chloramphénicol et/ou de gentamicine [519] pour inhiber la croissance de bactéries buccales.
Il est possible d’adjoindre au milieu de la cycloheximide (Actidone®) qui inhibe la croissance de la plupart des champignons filamenteux susceptibles de contaminer les cultures. Toutefois, cette molécule peut inhiber la pousse de certaines espèces de Candida telles que C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis ou C. famata [520, 521].
Placés en étuve à 37°C ou laissé à température ambiante, le milieu de culture se couvre en 24 à 48 heures de colonies hémisphériques mesurant quelques milimètres de diamètre. Plutôt blanchâtre, leur surface est lisse, brillante et luisante, ou plus rarement, croûteuse, terne, sèche, mate ou ridée. Les associations de différentes espèces sont difficilement décelables par un œil non expérimenté [4].
Leur taille est inversément proportionnel à la densité des colonies. Leur nombre doit être noté approximativement; parfois, les colonies, très nombreuses et alors de petite taille, forment une nappe uniforme recouvrant totalement la gélose [468].
Les milieux chromogéniques.
Ces milieux, auquels sont ajoutés des substances chromogènes, confèrent aux colonies qui s’y développent une coloration particulière, variable en fonction de l’espèce. Cette coloration est dans la plupart des cas fondée sur la mise en évidence d’une activité de type hexosaminidase (N-acétyl-β-D-galactosaminidase). La multiplication des bactéries est également inhibée sur ces milieux.
De nombreux milieux chromogéniques sont disponibles dans le commerce, la plupart permettent d’identifier correctement C. albicans, les colonies se colorant en bleu (Candida ID® 2, bioMérieux) ou en vert (CHROMagar® Candida, Becton-Dickinson). Des sensibilités supérieures à 99% pour la détection de C. albicans sont rapportées par les différents fabricants.
C. tropicalis, C. lusitaniae et C. kefyr forment des colonies roses sur Candida ID© 2 tandis que C. dubliniensis présente les même caractéristiques culturales que C. albicans.
Le milieu CHROMagar Candida permet de distinguer C. duliniensis dont les colonies sont d’un vert plus fonçé que celles de C. albicans [523].
C. tropicalis forme des colonies bleu métallique et C. krusei des colonies roses pâles plutôt rugeuses. La sensibilité de C. tropicalis sur ce milieu n’est que d’environ 66% [525] et d’autres espèces (C. parapsilosis, C. lusitaniae, C. kefyr,…) ainsi que d’autres genres (Cryptococcus, Saccharomyces) peuvent produire des colonies roses d’aspect similaire.
Il faut donc se souvenir que l’identification des espèces non-albicans demeure présomptive sur ces milieux et qu’une identification formelle nécessite des tests complémentaires.
Milieux fluorogéniques.
Le plus utilisé est le Fluoroplate® Candida de Merck. Ce milieu de culture contient, en plus d’une base nutritive d’extrait de levure, de la glycine, du glucose et le substrat fluorogénique MUGal comme indicateur. 99% des souches de Candida albicans contiennent l’enzyme N-acetyl-β-D-Galactosaminidase, qui agit sur le substrat 4-méthylumbelliféril-N-acétyl-β-D-Galactosaminide (MUGal), formant le 4-métylumbeliférone reconnaissable à sa fluorescence à la lumière UV (366 nm) [526].
Même si une sensibilité et une spécificité supérieure à 99% à été décrite, l’utilisation de tels tests est limitée en raison de l’équipement spécifique requis.
Interprétation des résultats.
La présence de Candida sur la muqueuse buccale n’autorise pas à affirmer son rôle pathogène. En effet, si tout culture positive à partir d’un prélèvement normalement stérile (LCR, urine, biopsie tissulaire,…) témoigne d’une infection, en revanche la muqueuse buccale est fréquement colonisée par des levures commensales. Dans ce cas, les colonies sont peu nombreuses. Toutefois, le nombre de colonie ne constitue pas un élément suffisant pour juger: hormis les mauvaises techniques de prélèvement et d’ensemencement qui réduisent le nombre de colonies sur le milieu de culture, les candidoses buccales chroniques donnent également des cultures pauvres en colonies.
On considère néanmoins que la présence de 5 à 10 colonies de levures sur une culture réalisée à partir d’1 cm2 de surface oropharyngée écouvillonnée ou par mililitre de solution de rinçage buccal plaide en faveur du caractère pathogène du Candida isolé [4].
En définitive, il faut tenir compte, en plus de la quantité de Candida prélevée dans le milieu buccal, de l’existence de manifestations évoquant une candidose et de leur évolution favorable sous traitement antifongique [468].
Identification de C. albicans
En présence de colonies bien individualisées, l’identification précise de l’espèce isolée peut être réalisée par différentes méthodes.
Test de germination.
Le test de blastèse ou test de Taschadjian est apparu en 1960 [527]. On incube les Candida durant 3 à 4 heures dans du sérum de veau, de mouton ou de lapin à 37°C. Si le Candida isolé est C. albicans, on observe dans 95% des cas la production par les cellules mères de tubes germinatifs.
Longtemps considérée comme la méthode de référence, ce test présente une fiabilité limitée puisque 5% des C. albicans ne produisent pas de tubes germinatifs et que des espèces comme C. tropicalis et C. parapsilosis produisent des structures similaires appelées « tubes germinatifs-like » De plus, C. dubliniensis est également capable de produire des tubes germinatifs, raison pour laquelle il a longtemps été confondu avec C. albicans. Pour ces raisons, ce test est de moins en moins utilisé [532, 533].
Test de chlamydosporulation.
On ensemence les levures sur milieu PCB (pomme de terre, carotte, bile) ou RAT (riz,
agar, tween 80) et on incube à 37 °C pendant 24 heures.
La présence de chlamydospores, structures arrondies de 10 à 15 μm entourées d’une
paroi épaisse à double contour, signifie qu’il s’agit dans 95% des cas d’un Candida albicans.
Récement, des milieux tournesol-agar [529], agar de Staib [528], caséine-agar [530], tabac-agar [531] ont permis d’induire le chlamydosporulation sélectivement chez C. dubliensis permettant ainsi sa différenciation de C. albicans.
Test immunologique.
Des tests immunologiques utilisants des anticorps monoclonaux [534-537] ou polyclonaux [538, 539] reconnaissant des épitopes pariétaux spécifiques à certaines espèces de Candida ont été développés. Ces méthode avaient l’inconvénient d’une spécificité limitée ou n’étaient pas disponible dans le commerce.
On utilise actuelement des billes de latex colorées qui ont été sensibilisées par un anticorps monoclonal reconnaissant un antigène pariétal spécifique. Par exemple, Bichrolatex ® albicans (Fumouze Diagnostics, Asnières, France) permet la co-agglutination de particules de latex colorées en rouge sur des constituants pariétaux de C. albicans avec une sensibilité et une spécificité approchant les 100% [540].
Un nouveau dispositif d’immunochromatographie sur membrane (ICM) à récemment été proposé. Le test ICM albi-dubli, (SR2B, Avrille, France) utilise deux anticorps monoclonaux et permet d’identifier C. albicans et C. dubliniensis (ou d’exclure les deux espèces). Une sensibilité et une spécificité de respectivement 93,1% et 100% pour C. albicans et de 98,3% et 97,9% pour C. dubiniensis ont été démontrées [541].
Test métabolique.
Trois tests sont actuellement commercialisés pour la détection de C. albicans: MUREX C. albicans (Murex Diagnostics), Albicans-Sure (Clinical Standards Laboratories) et BactiCard Candida (Remel).
Ces trois tests se basent sur le fait que la double-activité β-galactosaminnidase et L-proline aminopeptidase n’est rencontrée que chez C. albicans. Les autres espèces peuvent présenter l’une ou l’autre de ces activité mais jamais les deux associées. Ces trois tests présentent une sensibilité et une spécificité conprise entre 98,7% et 100% [542]
Identification d’espèces non-albicans
Réduction de sels de tétrazolium.
Cette technique historique décrite par Pagano, Levin et Trejo en 1958 [543] repose sur la réduction du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium qui, incorporé dans le milieu de culture, confère aux colonies une couleur allant du blanc au rouge selon les espèces [544].
Tests immunologiques.
Il s’agit à nouveau de test d’agglutination de particules de latex porteuses d’anticorps spécifiques pour l’espèce recherchée. On peut citer Kruseicolor® pour C. krusei et Bichrodubli® pour C. dubliniensis (Fumouze diagnostic). La sensibilité et la spécificité de ces deux tests se situent aux alentours de 100% et le résultat est disponible en quelques minutes [545, 546].
Test enzymatique.
Tout comme C. kruzei, C. glabrata, pose des problèmes de résitance aux azolés [547]. Le test Glabratta RTT ® (Fumouze Diagnostic) permet d’identifier ses colonies en 20 minutes en utilisant sa capacité à hydrolyser le thréalose et pas le maltose. La sensibilité et la spécificité se situent entre 91% et 98% selon les milieux de culture et les études [548-550].
Etude des caractères physiologiques.
Un grand nombre de dispositifs miniaturisés basés sur l’assimilation des hydrates de carbones (auxanogramme) et leur fermentation (zymogramme) sont commercialisés.
Le nombre de sucres testés varie selon les fabricants. Par exemple la galerie ID® 32C (bioMérieux) comprend 29 sources de carbone ainsi qu’un test de sensibilité à l’actidone et un test à l’esculine; elle nécessite près de trois jours d’incubation et demeure aujourd’hui un système de référence [4].
Identification moléculaire.
Dans le domaine de la recherche, une multitude de publications relatent le développement de techniques de PCR permettant l’identification de levures déjà isolées [551].
En tout état de cause, l’approche moléculaire et plus particulièrement le séquençage ne se justifient que lorsque l’identification d’espèce pose un véritable problème et ne peut être réalisée par une approche phénotypique. Le coût de ce type d’analyse est en effet très supérieur à celui des techniques mycologiques classiques et le recours à la biologie moléculaire ne s’envisage généralement que dans un contexte de candidose invasive. En effet, dans ce type de pathologie, l’identification exacte de l’espèce revêt la plus grande importance en raison de la sensibilité variable aux antifongiques des différentes espèces de Candida [4].
Diagnostic indirect.
Le diagnostic indirect peut être entrepris lors de suspicion de candidose profonde. On peut rechercher des anticorps anti-Candida par hémagglutination indirecte (HAI), immunofluorescence indirecte (IFI), ELISA, ou immunoélectrophorèse.
La recherche d’antigènes circulants comme le D-arabinol (un pentose produit par toutes les espèces de Candida) ou le β-(1,3) D-glucane (constituant de la paroi fongique) peut permettre de poser le diagnostic de candidose invasive.
© Frédéric Born - Médecin-dentiste svmd-sso - Lausanne